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ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE BANDEO C EN Aloe vera (L.) Burm. f. (ALOACEAE)


C-banding technique standardization in Aloe vera (L.) Burm. f. (Aloaceae)

José Imery*, Andrea Menéndez**, María B. Raymúndez**

*Departamento de Biología, Universidad de Oriente, Cumaná-Venezuela. AP 245. jimery@sucre.udo.edu.ve
**Instituto de Biología Experimental (IBE), Universidad Central de Venezuela, Caracas-Venezuela. AP 47058. amenendez@cantv.net

Resumen

Se evaluó la tinción de heterocromatina constitutiva en células meristemáticas subapicales de A. vera, aplicando procedimientos basados principalmente en Ba(OH)2, SSC y Giemsa (BSG). La observación consistente de 11 agrupaciones de heterocromatina C en núcleos interfásicos y en regiones centroméricas de cromosomas metafásicos (6S y 5L) se logró con Ba(OH)2 (2%, 45 min, temperatura ambiente); SSC (2X, 60 min, 65°C); Giemsa (1% en búfer fosfato pH 7, 50 min) en combinación con otras condiciones experimentales que se describen en el presente trabajo. El resto de los protocolos evaluados, propuestos para otras especies vegetales, resultaron ineficientes o con escasa resolución para la evaluación de los atributos cariológicos de interés.

Introducción

La técnica de bandeo C con Giemsa ha facilitado la identificación individual de cromosomas en muchas especies vegetales, en función de los patrones característicos de distribución de la heterocromatina constitutiva (Singh 2003). Este tipo de tinción diferencial es útil en la detección de regiones cromosómicas que contienen secuencias de ADN altamente repetitivas, permitiendo la discriminación entre los cromosomas que componen el cariotipo (Friebe et al. 1996) y la determinación de polimorfismos (Endo & Gill 1984, Tardif & Morisset 1991, Jellen et al. 1993, Olin-Faith 1996, Cuellar et al. 1999), introgresiones y reordenamientos cromosómicos de interés para el análisis biosistemático o la mejora genética de plantas de importancia agrícola (Wei et al. 1995, Cai et al. 1996, Hohman et al. 1996, Wang et al. 1998).
El empleo de técnicas convencionales de tinción cromosómica ha permitido el análisis de pequeñas variaciones en el cariotipo bimodal (2n=2x=14) que caracteriza a la mayoría de las especies de Aloe (Brandham 1971, Brandham & Doherty 1998, Imery & Caldera 2002); sin embargo, hasta ahora no se ha registrado el aprovechamiento de los atributos cariológicos adicionales que podría ofrecer la tinción de heterocromatina C en este grupo vegetal. En este sentido, el objetivo del presente trabajo fue la obtención de un método de tinción que permita revelar nuevos marcadores citológicos de utilidad para futuros análisis citogenéticos de A. vera, sus congéneres, y/o de genotipos experimentales derivados de programas de mejora genética.

Materiales y Métodos

Inicialmente se ensayó con el método de tinción de Darvey & Gustafson (1975), el protocolo estándar de bandeo C establecido por Giraldez et al. (1979) y las modificaciones propuestas por Gill et al. (1991) y Friebe et al. (1996). La incapacidad de estas técnicas para revelar bandas C en el cariotipo de A. vera, conllevó a la estandarización de un protocolo específico de tinción de heterocromatina, variando principalmente las condiciones de pretratamiento, fijado, maceración, deshidratación, secado y los tratamientos con BSG. Se evaluaron los efectos del enfriamiento (0-4°C), 24 y 48 h; colchicina 0,05%, 2, 2,5 y 3 h como mitostáticos; fijadores 3:1 etanol/ácido acético (E/AA) y 5:3:2 E/AA/cloroformo (E/AA/C), 3, 24 y 48 h; macerado del tejido meristemático (AA 45% y ácido propiónico (AP) 45%, con y sin hidrólisis previa en HCl 0,2, 0,5 y 1 N, 5, 10, 15 y 20 min); tiempo de almacenamiento y secado de las láminas (1, 2, 7, 15 y 21 días) y las combinaciones de Ba(OH)2 (2, 5 y 10%, temperatura ambiente (TA) y 48-50°C, 5, 10, 15, 30, 45 y 60 min, con o sin filtrado); SSC 2X (52 y 65°C, 30, 60 y 90 min); Giemsa (0,5, 1, 3 y 5% de sol. Stock en búfer fosfato (BF) pH 6,8, 7 y 7,4 con monitoreo de tinción cada 5 min). Se emplearon plantas adultas conservadas bajo condiciones de vivero en el Departamento de Biología de la Universidad de Oriente, que procedían originalmente de una población naturalizada ubicada a 10º36'34" N y 64º07'18" O en la península de Araya, Estado Sucre, Venezuela.

Resultados y Discusión

A continuación se describe el protocolo estandarizado: Colecta de raíces activas de 2-3 cm, 7:30-8:00 AM. Lavado en agua corriente, 2 min. Pretratamiento con colchicina 0,05%, 2,5 h en ambiente oscuro y TA. Fijado en 5:3:2 E/AA/C, 4 °C, 3 h. Lavado en H2Od, TA, 2 min. Hidrólisis en HCl 0,5 N, TA, 15 min. Inmersión en AP 45%, TA, 10 min. Disección de ápice radical y macerado de meristema en 1 gota de AP 45%. Aplastamiento suave. Congelamiento de lámina, a -20°C, 30 min. Levantamiento rápido de cubreobjeto. Secado al aire, TA, 30 min. Deshidratación en etanol, TA, 5 h. Secado al aire, TA, 30 min. Incubación en estufa, 42°C, 24 h. Almacenamiento en ambiente seco y oscuro, TA, 2-3 semanas. Denaturalización en solución filtrada de Ba(OH)2.8H2O, 2%, TA, 45 min. Doble lavado en H2Od, TA, 5 min. Secado al aire, TA, 10 min. Renaturalización en SSC 2X (0,3 M NaCl, 0,03 M Na3C6H5O7.2H2O, pH 7,4), 65°C, 60 min. Doble lavado en H2Od, TA, 5 min. Secado al aire, TA, 15 min. Tinción con Giemsa 1% en BF pH 7, TA, 50 min. Doble lavado suave y rápido en H2Od. Secado al aire, TA, 3 h. Inmersión en xilol, TA, 2 h, montaje y observación al microscopio.
La combinación de reactivos y condiciones físico-químicas del protocolo estandarizado permitió visualizar las variables citológicas con suficiente resolución para reconocer claramente las regiones de heterocromatina constitutiva en cromosomas metafásicos y en núcleos interfásicos. Las bandas C se localizaron de forma consistente solo en la zona adyacente al centrómero en los seis cromosomas pequeños (S) y en cinco cromosomas grandes (L). En total, se observaron 11 bandas C en el cariotipo de A. vera, las cuales estuvieron asociadas al número máximo de corpúsculos oscuros, de forma globular y tamaño variable, revelados en núcleos interfásicos G1.
En conclusión, todas las variables experimentales contribuyen en mayor o menor grado a obtener la máxima calidad y resolución de los resultados; no obstante, se evidenció que el tratamiento preliminar con colchicina, E/AA/C y HCl; desecación adicional en etanol, maduración de las láminas por 2-3 semanas y la combinación precisa de BSG, son los pasos más importantes en el desarrollo de la técnica de tinción de heterochomatina C en A. vera.

Referencias
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